LA COPROLOGIE PARASITAIRE : Techniques de diagnostic

La coprologie parasitaire encore appelée examen parasitologique des selles constitue un ensemble de techniques qui mettent en évidence les parasites de l’appareil digestif (ainsi que les parasites dont les adultes ont une localisation vasculaire ou pulmonaire) ou ceux pour lesquels les selles constituent le véhicule normal de leurs formes de dissémination dans le milieu extérieur. dans cet article nous allons détailler les différentes technique de diagnostic.

see url Éléments à mettre en évidence et à identifier :   

  • Parasite sous sa forme définitive (forme adulte pour helminthes, forme végétative ou kystique pour les protozoaires)
  • Parasite sous une forme évolutive (œufs, larves pour helminthes)
  •   Éléments du parasite (anneaux pour ténias)

Conduite de l’examen coprologique

  • Examen macroscopique
  • Examen microscopique

   – Examen direct

   – Concentrations (Protozoaires, Helminthes, autres. ex. anguillules)

   – Colorations spécifiques    – Cultures

Examens particuliers

Ex. Test de Graham (Scotch test anal), biopsie intestinale,……..

I. EXAMEN MACROSCOPIQUE DES SELLES

Il permet de noter :

   – L’aspect , la couleur, la consistance(selles dures, pâteuses, semi-liquides ou franchement liquides)

   – La présence éventuelle de sang, de mucosités, lambeaux de desquamation de la muqueuse intestinale, de pus

   – Apprécier la digestion du bol alimentaire (résidus alimentaires)

   – La présence de parasites (anneaux de ténia, oxyures, ascaris, douves…).

Structures non parasitaires retrouvées dans les selles

  • Levures et spores
  • Bulles d’air
  • Graisse
  • Amidon 
  • Cheveux Cristaux de Charcot Leyden
  • Fibres végétales
  • Fibres musculaires
 


 

click II. EXAMEN MICROSCOPIQUE

PRINCIPE

Seul examen à l’état frais permettant de mettre en évidence les formes végétatives de protozoaires et d’étudier leur mobilité.

PRECAUTIONS : Eviter

  – Excès de selles pour une préparation transparente

  – Excès d’eau pour ne pas souiller le microscope.

L’excès de liquide peut être épongé avec du papier absorbant. Si la selle est liquide, l’ajout d’eau n’est pas nécessaire.

On distingue trois types d’examens microscopiques:

  •  Examen microscopique à l’état frais : examen direct
  •  Examen microscopique d’une ou deux techniques de concentration standard

  – Méthodes physiques : réactif iodo-mercurique

  – Méthodes diphasiques ou physico-chimiques : acéto-acétique / éther

  – Méthode combinée ou mixte

Techniques spéciales

  – Numération des œufs: technique de KATO

  – Extraction de parasites: méthode de BAERMANN et LEE

  – Scotch test anal ou test de Graham

1. EXAMEN DIRECT

Il est obligatoire Il s’effectue pendant la réalisation d’au moins deux techniques de routine de concentration Il renseigne sur :

  – l’aspect microscopique de la digestion

  – la présence de cellules

– la présence d’éléments parasitaires Techniques :

  – Examen direct en solution salée isotonique

  – Coloration au Lugol

Exemple : Coloration au Lugol

Coloration extemporanée permettant le diagnostic différentiel des amibes Réactif : solution de Lugol 1%

  – iode en paillettes : 1 g

  – iodure de potassium : 2 g

  – eau distillée : 100 ml

Dissoudre l’iodure dans très peu d’eau, ajouter l’iode peu à peu et compléter avec le reste de l’eau.

Mode opératoire :

  – Déposer une goutte de Lugol sur une lame porte objet propre

  – Prélever un fragment des selles en plusieurs endroits et l’étaler dans la goutte de Lugol

  – Réaliser un mélange homogène et recouvrir d’une lamelle

  – La préparation doit être mince et examinée en entier

Observer au microscope d’abord au grossissement 100 (obj x10), puis, une fois les éléments parasitaires confirmés au grossissement 400 (obj x 40).La chromatine ressort par contraste sur le cytoplasme beige clair. Dans cette solution, les protozoaires s’immobilisent rapidement mais que la chromatine des noyaux colorée en sombre est bien nette. Avec la solution de Lugol, la flore iodophile du colon apparaît en brun et l’amidon mal digéré en bleu ; l’amidon transformé en érythrodextrine est coloré en rouge violet.

2. MÉTHODES DE CONCENTRATION

On appelle concentrations les techniques par lesquelles on essaie, à partir de la grande quantité de matières fécales recueillies, d’obtenir dans un faible volume les œufs, larves, kystes voire formes végétatives fixées de parasites par élimination des résidus de la digestion. Pour ce faire, on joue sur les densités et affinités différentes de ces résidus et des parasites recherchés. Seront donc envisagées successivement les méthodes physiques, les méthodes physico-chimiques et les méthodes combinées.

A. Méthodes physiques

PRINCIPE : basées sur la différence de densité entre les éléments parasitaires et les débris alimentaires par rapport à un liquide de dilution 

  •  Techniques de sédimentation : utilisent un liquide dont la densité est inférieure à celle des éléments parasitaires 
  • Techniques par flottation : utilisent un liquide de densité supérieure à celle des éléments parasitaires qui se concentrent à la surface (ex. Willis)
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Avantages:

Cette technique, bien exécutée, permet de trouver de rares formes végétatives de protozoaires alors que les kystes sont inexistants. Elle est d’exécution rapide et surtout recommandée quand l’examen direct a prouvé la présence de rares formes végétatives et qu’aucun kyste n’a été retrouvé pour pouvoir affirmer le diagnostic.

Inconvénients:

  Une certaine technicité est indispensable pour ne pas confondre les amibes et flagellés avec les blastocystis et champignons qui sont un peu déformés. De plus une selle trop riche en lipides ne peut être ainsi concentrée.

A.1. Méthodes physiques: Sédimentation

PRINCIPE : Dilution des selles dans un liquide de densité « d »

débris alimentaires < d < éléments parasitaires

Technique peu utilisée

  • Intérêt: technique recommandée pour les larves d’anguillule et les œufs d’ascaris non fécondés. Elle ne nécessite pas de produit chimique particulier.
  • Inconvénients: de nombreuses cellules végétales (féculents en particulier) sédimenter à aussi vite que les parasites recherchés et l’examen microscopique n’est pas toujours facile. Valable pour les œufs de schistosomes (+ ou – œufs d’Ascaris). 

REALISATION :

  – 5 g de selles diluées dans 300ml d’eau glycérinée à 0.5% dans un verre à pied

  – 3 sédimentations successives accélérées par centrifugation

  – examiner le dépôt.

A.2. Méthodes physiques: Flottation

PRINCIPE :

Les méthodes de flottation reposent sur le principe que les œufs ont une coque qui les protège pendant un certain temps de la pénétration de liquides plus denses; une dilution avec ces liquides aura tendance à les laisser flotter en surface tandis que les résidus plus lourds ou ceux qui s’imprègnent rapidement tombent dans le fond des récipients. TECHNIQUES:

   – Méthode de Willis

   – Méthode de Faust simplifiée

   – Méthode de Janeckso et Urbanyi.

Méthode de Willis

REACTIF : solution saturée de NaCl à 25% (densité de la solution = 1,2) TECHNIQUE :

  – Diluer 2g de selles dans 20ml de la solution

  – Tamiser ensuite sur un tamis métallique et recueillir dans 1 tube cylindrique de 2.5cm de diamètre : il faut que la solution arrive à ras-bord et forme un ménisque sans bulle (éliminer les débris remontés à la surface s’il y a lieu).

– Poser une lamelle dégraissée à la surface du ménisque. Attendre 15 à 20 min.

– Retirer la lamelle puis la poser sur une lame porte-objet. Examiner rapidement.

INDICATIONS: œufs d’ankylostomes, d’Ascaris, d’Oxyures, d’Hymenolepis nana et de Trichocéphales

CONTRE-INDICATIONS: Larves / kystes / Douves / Schistosomes

Méthode de Janeckso-Urbanyi

PRINCIPE :la dilution fécale est réalisée dans un liquide de densité « d »            éléments parasitaires < d

les éléments parasitaires surnagent et se concentrent dans le film superficiel

REACTIFS : Solution d’iodo mercurate de potassium

  – Iodure mercurique…………………………………………….100g

  – Iodure de potassium…………………………………………..530g

  – Eau distillée ………………………………………………1000ml

Préparation de la solution d’iodo mercurate de potassium:

Dissoudre l’iodure de potassium dans le plus faible volume d’eau; ajouter lentement l’iodure mercurique en agitant. Après dissolution, diluer avec le reste de l’eau distillée. La densité de la solution = 1,440

TECHNIQUE : – Diluer 5g de selles dans 20ml de la solution

                       – Tamiser ensuite sur une gaze préalablement humidifiée

                       – Centrifuger à 2500 t/min pendant 3 minutes

                       – Attoucher la surface du liquide avec une lamelle. Déposer la lamelle sur une lame et observer au microscope.

AVANTAGES : Méthode rapide, assez polyvalente :

Indiquée pour la recherche des oeufs de : Fasciola hepatica, Shistosoma mansoni, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura, Strongyloides stercoralis, Taenia, Hymenolepis. Des larves de vers, les kystes de Giardia

Contre-indiquée pour les kystes d’amibes et pour les Ascaris.

INCONVENIENTS:

  – Prélèvement dès la fin de la centrifugation pour éviter déformation des éléments occasionnée par hypertonicité du milieu.

  – Action caustique et allergique du réactif (manipuler avec précaution).

  – Coût élevé des réactifs.

Méthode de Faust: solution aqueuse de sulfate de zinc

PRINCIPE : Même principe que la technique de Janeckso-Urbanyi mais REACTIF = ZnSO4 à 33%  et La densité de la solution = 1,180

B. Méthodes diphasiques ou physico-chimiques

PRINCIPE :

  Mettre les selles en présence de 2 phases non miscibles : une aqueuse et une organique (éther). En plus de l’action dissolvante de l’éther, la mise en jeu de 2 phases non miscibles réalise pour chaque élément fécal un coefficient de partage dont la valeur dépend de sa balance hydrophile / lipophile permettant ainsi de concentrer les éléments fécaux dans le culot.

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uEx. Ritchie, Teleman-Rivas, Bailenger

Après centrifugation on obtient quatre couches:

          . couche superficielle éthérée légèrement jaunâtre ;

          . couche épaisse contenant les résidus lipophiles ;

          . couche de solution aqueuse ;

          . culot devant contenir les parasites.

B.1. Méthodes diphasiques ou physico-chimiques: Méthode de Ritchie

PRINCIPE: Technique permettant de concentrer les kystes des protozoaires REACTIFS : – Solution aqueuse à 10% de formol pur (formol pur = solution formaldéhyde à 40%)

– Éther TECHNIQUE : – Délayer 2g. de selles dans 2Oml de solution de formol à 10%

                       – Tamiser sur tamis métallique et émulsionner 2ml du filtrat recueilli dans 1 tube en verre à centrifuger avec un égal volume d’éther en agitant vigoureusement pendant 30 sec.

   – Centrifuger à 2500 t/min pendant 3 à 5 minutes.

– A l’aide d’une pipette pasteur, récupérer le culot en éliminant les couches supérieures puis l’examiner entre lame et lamelle aux objectifs X10 et X40. INDICATIONS: kystes de protozoaires.

Avantages:

Cette méthode peut être utilisée sur les selles formulées donc sur des selles collectées pour enquêtes épidémiologiques. Elle concentre bien les œufs d’ascaris et de schistosome.

Inconvénients: le culot souvent volumineux est de lecture difficile.

B.2. Méthodes diphasiques ou physico-chimiques: Méthode de Bailenger

PRINCIPE : Méthode diphasique, effectuée en milieu tamponné à pH=5 REACTIFS : Tampon acéto-acétique pH 5

   – Acétate de sodium cristallisé……………………………..15g

   – Acide acétique………………………………………………3.60ml

   – Eau distillée………………………………………………….1000ml

   Ajuster à pH=5 avec de l’acide acétique afin de favoriser la concentration parasitaire

   – Éther éthylique.

TECHNIQUE :

   – Délayer 2 à 3 g de selles avec 10 fois son volume en tampon

   – Tamiser sur tamis métallique et recueillir dans 1 tube en verre à centrifuger

   – Ajouter 1 volume égal d’éther et agiter vigoureusement

   – Centrifuger à 2500 t/min pendant 3 min.

   – Retirer les couches supérieures et examiner le sédiment entre lame et lamelle

Cette méthode analogue à la méthode de Teleman-Rivas donne de meilleurs résultats.  INDICATIONS:

   – Œufs d’helminthes

   – Kystes de Protozoaires

   – Cryptosporidies.

C. Méthodes mixtes ou combinées

Chaque méthode de concentration proposée présente l’inconvénient d’éliminer des parasites et doit donc être choisie en fonction de ce que l’on recherche préférentiellement. Les méthodes les plus intéressantes pour la diversité des kystes ou œufs concentrés laissent souvent à examiner un culot relativement important. En combinant flottations et méthodes diphasiques, C. Junod obtient d’excellents résultats.

C.1 Méthodes mixtes ou combinées:
Technique de
Junod

REACTIFS : – Solution de formol diluée à 10%

                       – Éther éthylique

                       – Solution d’iodo mercurate de potassium uTECHNIQUE : – Diluer 2 à 3 noix de selles dans 50ml d’une solution diluée de formol à 10%

                           – Tamiser et transférer dans un tube conique rempli aux 3/4

                           – Rajouter éther jusqu’en haut et agiter vigoureusement pendant 30 sec.

 – Centrifuger à 2500 t/min pendant 3 à 5 minutes

   – Reprendre le culot par 10ml de solution d’iodomercurate de potassium, remettre en suspension et centrifuger 30 sec à 2500 t/min

   – Verser délicatement le surnageant dans un autre tube conique, le remplir d’eau du robinet et centrifuger 3 minutes à 2500 t/min

   – Vider le surnageant. Examiner le culot.

III- Techniques spéciales

NUMERATION DES OEUFS 

  • Cette technique permet d’apprécier l’intensité d’une infestation et les possibilités de retentissement physiologique des parasitoses (anémie due ou non aux ankylostomes présents), de juger de l’efficacité d’une thérapeutique.
  • Le nombre d’œufs trouvés dans les selles est généralement proportionnel au nombre de vers, pour les protozoaires.
  • Les résultats sont rendus en nombre d’œufs par gramme de selles.

1. Technique de KATO

Principe : C’est une technique de décoloration des selles qui permet de distinguer les œufs de parasites (helminthes) dans une préparation des selles rendue translucide. Le but de cette méthode est la confection d’un frottis épais que l’on éclaircit. Méthode efficace pour la recherche d‘œufs d’ascaris et de trichocéphale, mais inutilisable pour les kystes et les larves

Réactif et matériel :

    – Réactif de Kato   (Solution de glycérine-vert malachite): glycérine 100 ml, eau distillée 100 ml solution de vert malachite à 3 % 1 ml

    – un petit cristallisoir

    – lame porte-objet

    – papier filtre

    – bandes de cellophane adhésive de 2 x 3 cm immergées dans la solution de glycérine pendant 24 heures.

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Mode opératoire

1. Faire tremper des bandes de cellophane dans le réactif de Kato pendant au moins 24 heures.

2. Les égoutter avant usage.

3. Déposer une petite noisette de selles sur la lame.

4. Appliquer dessus une bande de cellophane.

5. Retourner et appuyer le montage sur du papier filtre pour que la matière fécale s’étale entre lame et cellophane.

6. Laisser éclaircir une heure à la température du laboratoire (ambiante).

7. Lire sans attendre car un sur-éclaircissement risquerait de faire passer inaperçu certains œufs (Ankylostomes, Schistosomes).

Remarques

  • La chaleur ambiante et la glycérine éclaircissent complètement la préparation
  • Les œufs et les coccidies conservent leurs contours et peuvent être facilement reconnus. Par contre, les kystes de protozoaires deviennent parfaitement transparents et invisibles.

2. Méthode de BAERMANN et LEE:
Méthode biologique de concentration des larves de Strongles

Principe : On met à profit l’hygrotropisme et le thermotropisme des larves d’Anguillules et d’Ankylostomidés.

Les larves rahbditoïdes d’anguillule ont un hydrothermotropisme positif. En mettant en contact des selles contenant des larves avec de l’eau chaude celles-ci seront attirées vers l’eau où elles seront facilement repérées. Appareillage :

   L’appareil de Baermann est composé d’un entonnoir fixé à une potence. Cet entonnoir est prolongé par un tube clampé. Le prélèvement est disposé dans de la gaze placée dans une passoire à thé, le tout étant posé sur l’entonnoir.

Appareillage :
  Le plus simple est d'utiliser un entonnoir à robinet; à défaut pourra être employé un entonnoir ordinaire se terminant par un tuyau de caoutchouc fermé d'une pince de Mohr.

TECHNIQUE :

  – Dans 1 passoire à fond conique, disposer 1 carré de gaze double (+ ou – 1 épaisseur de papier filtre si selle diarrhéique) ou 1 tamis métallique conique.

  – Déposer une noix de selle et recouvrir la passoire d’un verre de montre.

  – La passoire est alors plongée dans 1 entonnoir fermé contenant de l’eau à 40°C à mi hauteur.

  – Les larves d’anguillules et d’ankylostomes ayant des propriétés hydrophiles et thermophiles migrent et se concentrent dans l’eau que l’on soutire alors grâce au robinet au bout de 2 heures.

 Centrifuger 2 min. à 2000 t/min et observer les larves mobiles dans le culot.

  – Déposer quelques gouttes prélevées au fond de la solution (ou du culot) sur une lame porte objet.

  – Observer directement au microscope sans recouvrir d’une lamelle.

  – Si l’examen est négatif au bout de 2 heures, prélever l’eau après 24h.

Larve strongyloïde

Avantages

   – La technique est facile et peu coûteuse.
   – L’enrichissement obtenu est bon et les débris sont limités dès lors que l’appareil n’a pas été secoué au cours de l’examen.
   – Cette méthode est la meilleure pour la récolte et l’identification des larves de Nématodes.

   – Ces larves sont facilement isolées et non déformées contrairement à la technique de flottation.

Limites

   – La méthode de Baermann ne permet d’isoler que des larves.
   – L’analyse quantitative n’est pas possible ultérieurement car les larves sont difficilement dénombrables en cellule de Mac Master et que leur répartition dans la solution récoltée n’est pas homogène.
   – Il faut impérativement que les matières fécales soient fraîches pour que les larves qu’elles contiennent soient vivantes.
   – La réalisation de la méthode est assez longue.

3. TEST DE GRAHAM OU SCOTCH TEST ANAL 

PRINCIPE: Mise en évidence des œufs d’oxyures ou de ténias dans les plis anaux.

TECHNIQUE

   – Appliquer une cellophane adhésive au niveau de la marge anale le matin avant toute toilette intime et l’apposer sur une lame porte objet.

– Observer aux objectifs x10 et x40.

INDICATION: œufs d’oxyures, embryophores de Taeniasp.

Intérêt et limites de l’examen coprologique

Intérêt: diagnostic de certitude, enquête épidémiologique

Limites :

  – confusions et faux positifs: résidus alimentaires, graisses, savons; amidon, pollens, spores de champignons; éléments endogènes (leucocytes, cellules épithéliales)

  – faux négatifs: ils doivent être écartés par le choix le choix de technique et par la répétition des prélèvements.

CONCLUSION 

Chaque parasite ou groupe de parasites n’est bien mis en évidence que par une technique qui lui est spécifiquement adaptée, L’examen parasitologique des selles va ainsi permettre le dépistage et le diagnostic étiologique des maladies parasitaires, ce qui permettra au clinicien de démarrer ou de réajuster une action thérapeutique efficace/bien adaptée au malade et à son contexte épidémiologique. uD’où la nécessité pour le biologiste d’être concentré lors de manipulations;

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About the Author: Arthur Westmann

DEFFE ARTHUR (AMOEBAMANN) is the founder and author of MLTGEEKS and MLTEXPO.He’s from Cameroon and is currently a Final year State Medical Laboratory Technician (MLT MA). Beyond lab works, he’s a passionate internet user with a keen interest in web design and blogging. Furthermore He likes traveling, hanging around with friends and social networking to do in his spare time.

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